课程内容
《血红蛋白的提取和分离》
本课题学习目标
体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理
1、主要概念：①凝胶色谱法②电泳法散缓冲溶液④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用
2、主要原理：
①凝胶色谱法分离蛋白质的原理
2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理
②电泳法分离样品的原理
③缓冲溶液的组成和作用机理
3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法
4、课题难点：
①样品的处理
②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填
1、提问：用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。
2、提问：血液有哪些成分？
血液：血浆：水分
固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等
血细胞：白细胞
血小板
红细胞（最多）→血红蛋白（90%）：两个α—肽键
两个β—肽键
四个亚铁红素集团
血红蛋白的特点：每个肽键环绕一个亚铁血红素基因，此基因可携带一个分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色
血红蛋白：两个α—肽键
两个β—肽键
四个亚铁红素集团
一、血红蛋白的提取和分离1、分离生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子
2、蛋白质分离和提取的原理：
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
（一）凝胶色谱法（分配色谱法）
1、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离
2、凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多空小球体，内部有许多贯穿的通道。
3、凝胶色谱法的原理
①但相对分子量不同的蛋白质通过凝胶使，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。
4、凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程
a、相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部面被滞留，相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过
b、（1）蛋白质混合物上柱；（2）洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质被排阻于颗粒之外；（3）相对分子质量较小的蛋白质被滞留，相对分子质量较大的蛋白质向下移动；（4）相对分子质量不同的分子完全分开；（5）相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在进行中。
（二）缓冲溶液
1、概念：在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值保持不变的混合溶液。
2、作用：能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变
3、缓冲溶液的配制：通常由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。
提问：在本课题中使用的缓冲液是：磷酸缓冲液
其目的是：利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）
（三）电泳
1、概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程
2、原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
3、类型：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。
二、实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤
样品处理→粗分离→纯化→纯度坚定
（二）操作过程
1、样品的处理：本课题可选用猪牛羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白
（1）红细胞的洗涤：
①洗涤目的：去除杂蛋白，已利用后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少
②洗涤操作：1、采集血样；2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9%的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。
（2）血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂），细胞劈裂释放出血红蛋白。
（3）分离血红蛋白溶液：
①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。②试管中溶液层次：第一层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第二层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第三层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第四层（最下层）：杂志沉淀（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
（4）透析：
①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（PH为7.0），透析12小时
②透析目的：除去样品中分子量较小的杂志
2、凝胶色谱操作：
（1）凝胶色谱柱的制作：
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需要砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质粉李不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。
（2）凝胶色谱柱的装填
①凝胶的选择：A：材料：交联聚糖凝胶（G—75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸收7.5克。
②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。
③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（PH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发送洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
（3）样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降，到与凝胶面平齐，关闭出口。
②地价透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加氧=样，同时注意不要破坏凝胶面
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口
④洗脱：小心加入PH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）
⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
思考下面的问题：
1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？
让血红蛋白处在稳定的PH范围内，维持结构和功能正常
2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？
血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？
血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步：包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放，离心等操作收集到血红蛋白溶液，即：样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即：样品的纯化，最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
教学反馈
1、凝胶色谱法是根据（B）分离蛋白质的有效方法
A、分子的大小
B、相对分子质量的大小
C、带电荷的多少
D、溶解度
2、缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（B）基本不变
A、温度
B、PH
C、渗透压
D、氧气浓度
3、电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷B的电极移动
A、相同
B、相反
C、相对
D、相向
4、哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（A）与氧气的运输有关
A、血红蛋白
B、肌红蛋白
C、肌动蛋白
D、肌球蛋白
5、血液由血浆和各种血红细胞组成，其中（C）的含量最多
A、白细胞
B、血小板
C、红细胞
D、淋巴细胞
6、为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（D）
A、NaCl
B、甲苯
C、蒸馏水
D、柠檬酸钠
7、将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第三层是（C）
A、无色透明的甲苯层
B、脂溶性物质的沉淀层
C、血红蛋白的水溶液
D、其他杂质的暗红色沉淀物
