课程内容

《多聚酶链式反应扩增DNA片断》
一、基础知识
（一）DNA分子的结构
1、组成元素
C、H、O、N、P
2、基本单位
脱氧核苷酸
3、脱氧核苷酸结构
脱氧核苷酸：磷酸
            脱氧核苷：脱氧核糖
            含氮碱基：嘌呤：腺嘌呤（A）
                      鸟嘌呤（G）
                      嘧啶：胞嘧啶（C）
                      胸腺嘧啶（T）
4、多脱氧核苷酸链的形成
一个核苷酸上的磷酸基团上的“-OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羧基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、；磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羧基“-OH”末端称为3'端，而磷酸基团的末端称为5'端
5、DNA分子的双螺旋结构
①DNA分子是由两条反相平行的（即一条链为3'-5'，另一条链为5'-3'）脱氧核苷酸链盘旋而成的规则双螺旋结构
②脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧
③两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对
6、利用碱基互补配对规律的计算
规律：DNA双链中的两条互补链的碱基相等。任意两个互补的碱基之间和相等即A=T,G=C。任意两个不互补的碱基之和恒等，占碱基总数的50%。及：A+G=T+C=T+G=50%,(A+G)/(T+C)=(A+C)/(G+T)=(T+C)/(A+G)=1
规律二：在DNA双链中的一条单链(A+G)/(T+C)的值与另一条互补链的(A+G)/(T+C)的值互为倒数关系
规律三：DNA双链中，一条单链的(A+T)/(G+C)的值与另一条互补链的(A+T)/(G+C)的值是相等的，也与整个DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等
（二）DNA分子的特性
1、稳定性
在DNA分子双螺旋结构的内侧，通过氢键形成的碱基对，使两条脱氧核苷酸长链稳固的并联起来。）
2、多样性
构成DNA分子的碱基对的数量不同，碱基对的排列顺序千变万化
3、特异性
不同的DNA分子由于碱基对的排列顺序存在差异，因此每一个DNA分子的碱基对都有其特点的排列顺序，这种特定的排列顺序包含着特定的遗传信息，每一种生物(A+T)/(G+C)的比值是特定的
（三）DNA的复制
1、概念
由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程
2、时期
有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期
3、场所
细胞核（主）、线粒体、叶绿体
4、模板
DNA母链
5、原材料
脱氧核苷酸
6、基本条件
酶、ATP、原料、模板
7、复制过程
①解旋
②合成
③复旋
①解旋提供准确模板
条件：ATP供能  解旋酶
解开的两条单链叫母链（模板链）
②合成互补子链
模板：两条母链
原料：游离的4种脱氧核苷酸
酶：合成酶
原则：碱基互补配对原则
③子、母链结合盘绕形成新DNA分子：
8、复制特点
边解旋边复制（过程）
半保留复制（结果）
9、遵循原则
碱基互补配对原则
10、精确复制的原因
①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板
②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行
11、复制的意义
DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性
（四）PCR（多聚酶链式反应）
1、DNA聚合酶特性
不能从头合成DNA，只能从DNA的3'端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物
2、DNA聚合酶作用过程
当引物与DNS母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3'端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸
3、PCR原理
①在80-100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性
②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链
③PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器
4、Taq DNA聚合酶的应用
高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化
5、缓冲液需要为PCR反应提供的物质
DNA模板，分别与两套模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNS聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行
6、PCR技术的特点
PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好。易自动化等突出特点
7、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别

体内DNA的复制		体外的模拟
模板（母链）	细胞内源	外源加入
引物	引物合成酶	外源加入
底物dNTP	细胞内源	外源加入
聚合酶	细胞内源	外源加入
反应环境	细胞内环境	缓冲液

8、细胞内复制和PCR不同点
①PCR过程需要的引物一般是人工合成的DNA单链，其长度通常为20-30个脱氧核苷酸
②PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
（五）PCR的反应过程
1、PCR的反应步骤
PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤——变性、复性和延伸
2、循环过程
①变性（模板DNA解旋）
模板DNA经加热至90℃以上。一定时间后，使模板DNA双链经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备
PCR循环第一步：加热变性
②复性（退火）
模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合
PCR循环第二步：引物与靶序列退火
③模板DNA-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链
PCR循环第三步：引物延伸
第一个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列
3、30次循环后靶序列扩增的数量
4、PCR循环的结果
①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行Ⅰ的延伸
②DNA聚合酶只能在特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。
二、PCR的实验操作
（一）设备及用具
1、PCR仪
实质上一台能够自动调控温度的仪器
2、微量离心管
一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml
3、微量移液器
用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次
（二）实验操作步骤
1、准备
按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上
2、移液
用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂
3、混合
①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁
②注意：A离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢
B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀
4、；离心
①过程：将微量离心管放在离心机上，离心约10s
②离心目的：使反应液集中在离心管底部，提高反应效果
5、反应：
将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。

循环数	变性	复性	延伸
第一次	94℃ 10min	-	-
30次	94℃ 30s	55℃,30s	72℃ 1min
最后一次	94℃ 1min	55℃,30s	72℃ 1min

6、注意事项
PCR技术高度灵敏，为了避免外援DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：
①隔离操作区：所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；
②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头
三、课题成果评价
（一）理论上DNA扩增的计算
1、一条DNA，复制n次，DNA为2的n次方
2、a条DNA，复制n次，DNA为a乘以2的n次方
（二）实验中1、一条DNA，复制n次，DNA为2的n次方含量的测定
1、原理
可以通过计算1、一条DNA，复制n次，DNA含量评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关
2、过程
①稀释
PCR反应液，加入98ul蒸馏水，即将样品进行50倍稀释
②对照凋零
以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调至零
③计算
取DNA稀释液100ul至比色杯中，测定260nm处的光吸收值
④计算
DNA含量（ug）=50×（260nm的读数）
                  ×稀释倍数
50:1ug/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02
五、实验小结
PCR仪加热使（模板）变性，复性使引物与模板DNA（互补），延伸需将反应温度升至中温（72℃），在（Taq聚合酶）的作用下，以四种脱氧核苷酸为原料，以（引物）为复制的起点，合成新链。如此重复改变反应温度，经（变性、复性和延伸）三个阶段为一个循环，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍，一般样品经过30次循环，最终使基因放大了数百万倍；将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。