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    高中生物专题5课题2《多聚酶链式反应扩增DNA片断》(选修1)

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    课程内容


    《多聚酶链式反应扩增DNA片断》

    一、基础知识
    (一)DNA分子的结构
    1、组成元素
    C、H、O、N、P
    2、基本单位
    脱氧核苷酸
    3、脱氧核苷酸结构
    脱氧核苷酸:磷酸
                脱氧核苷:脱氧核糖
                含氮碱基:嘌呤:腺嘌呤(A)
                          鸟嘌呤(G)
                          嘧啶:胞嘧啶(C)
                          胸腺嘧啶(T)
    4、多脱氧核苷酸链的形成
    一个核苷酸上的磷酸基团上的“-OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羧基之间失去一分子水,形成磷酸二酯键,即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、;磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羧基“-OH”末端称为3'端,而磷酸基团的末端称为5'端
    5、DNA分子的双螺旋结构
    ①DNA分子是由两条反相平行的(即一条链为3'-5',另一条链为5'-3')脱氧核苷酸链盘旋而成的规则双螺旋结构
    ②脱氧核糖与磷酸交替连结,排列在外侧,构成基本骨架;碱基排列在链的内侧
    ③两条链上的碱基通过氢键连结起来,形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律:即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对,鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对
    6、利用碱基互补配对规律的计算
    规律:DNA双链中的两条互补链的碱基相等。任意两个互补的碱基之间和相等即A=T,G=C。任意两个不互补的碱基之和恒等,占碱基总数的50%。及:A+G=T+C=T+G=50%,(A+G)/(T+C)=(A+C)/(G+T)=(T+C)/(A+G)=1
    规律二:在DNA双链中的一条单链(A+G)/(T+C)的值与另一条互补链的(A+G)/(T+C)的值互为倒数关系
    规律三:DNA双链中,一条单链的(A+T)/(G+C)的值与另一条互补链的(A+T)/(G+C)的值是相等的,也与整个DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等
    (二)DNA分子的特性
    1、稳定性
    在DNA分子双螺旋结构的内侧,通过氢键形成的碱基对,使两条脱氧核苷酸长链稳固的并联起来。)
    2、多样性
    构成DNA分子的碱基对的数量不同,碱基对的排列顺序千变万化
    3、特异性
    不同的DNA分子由于碱基对的排列顺序存在差异,因此每一个DNA分子的碱基对都有其特点的排列顺序,这种特定的排列顺序包含着特定的遗传信息,每一种生物(A+T)/(G+C)的比值是特定的
    (三)DNA的复制
    1、概念
    由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程
    2、时期
    有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期
    3、场所
    细胞核(主)、线粒体、叶绿体
    4、模板
    DNA母链
    5、原材料
    脱氧核苷酸
    6、基本条件
    酶、ATP、原料、模板
    7、复制过程
    ①解旋
    ②合成
    ③复旋
    ①解旋提供准确模板
    条件:ATP供能  解旋酶
    解开的两条单链叫母链(模板链)
    ②合成互补子链
    模板:两条母链
    原料:游离的4种脱氧核苷酸
    酶:合成酶
    原则:碱基互补配对原则
    ③子、母链结合盘绕形成新DNA分子:
    8、复制特点
    边解旋边复制(过程)
    半保留复制(结果)
    9、遵循原则
    碱基互补配对原则
    10、精确复制的原因
    ①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板
    ②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行
    11、复制的意义
    DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代,从而保持了遗传信息的连续性
    (四)PCR(多聚酶链式反应)
    1、DNA聚合酶特性
    不能从头合成DNA,只能从DNA的3'端开始延伸DNA链,因此,DNA复制需要引物
    2、DNA聚合酶作用过程
    当引物与DNS母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶就能从引物的3'端开始延伸DNA链,DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸
    3、PCR原理
    ①在80-100℃的温度范围内,DNA的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性
    ②当温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链
    ③PCR利用了DNA的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合,现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器
    4、Taq DNA聚合酶的应用
    高温解决了打开双链的问题,但是,又导致DNA聚合酶失活的问题,耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题,促成了PCR技术的自动化
    5、缓冲液需要为PCR反应提供的物质
    DNA模板,分别与两套模板链相结合的两种引物,四种脱氧核苷酸,耐热的DNS聚合酶,同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行
    6、PCR技术的特点
    PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好。易自动化等突出特点
    7、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别

    体内DNA的复制 体外的模拟
    模板(母链) 细胞内源 外源加入
    引物 引物合成酶 外源加入
    底物dNTP 细胞内源 外源加入
    聚合酶 细胞内源 外源加入
    反应环境 细胞内环境 缓冲液
    8、细胞内复制和PCR不同点
    ①PCR过程需要的引物一般是人工合成的DNA单链,其长度通常为20-30个脱氧核苷酸
    ②PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的
    (五)PCR的反应过程
    1、PCR的反应步骤
    PCR一般经历三十多次循环,每次循环可以分为三个基本步骤——变性、复性和延伸
    2、循环过程
    ①变性(模板DNA解旋)
    模板DNA经加热至90℃以上。一定时间后,使模板DNA双链经PCR扩增形成的双链DNA解离,使成为单链,以便于它与引物结合,为下轮反应作准备
    PCR循环第一步:加热变性
    ②复性(退火)
    模板DNA经加热变性成单链后,温度降到50℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合
    PCR循环第二步:引物与靶序列退火
    ③模板DNA-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料,以母链为模板,按碱基互补配对原则与半保留复制的原理,合成一条新的DNA链
    PCR循环第三步:引物延伸
    第一个PCR循环完成后:得到两个拷贝的靶序列
    3、30次循环后靶序列扩增的数量
    4、PCR循环的结果
    ①从第二轮循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反应,并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合,进行Ⅰ的延伸
    ②DNA聚合酶只能在特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。
    二、PCR的实验操作
    (一)设备及用具
    1、PCR仪
    实质上一台能够自动调控温度的仪器
    2、微量离心管
    一种薄壁塑料管,总容积为0.5ml
    3、微量移液器
    用于定量转移PCR配方中的液体,其上的一次性吸液枪头用一次更换一次
    (二)实验操作步骤
    1、准备
    按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上
    2、移液
    用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂
    3、混合
    ①过程:盖严微量离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管壁
    ②注意:A离心管口的盖子一定盖严,防止实验中脱落或液体外溢
    B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁,目的是使反应液混合均匀
    4、;离心
    ①过程:将微量离心管放在离心机上,离心约10s
    ②离心目的:使反应液集中在离心管底部,提高反应效果
    5、反应:
    将离心管放入PCR仪上,设置好PCR仪的循环程序。
    循环数 变性 复性 延伸
    第一次 94℃
    10min
    - -
    30次 94℃
    30s
    55℃,30s 72℃
    1min
    最后一次 94℃
    1min
    55℃,30s 72℃
    1min
    6、注意事项
    PCR技术高度灵敏,为了避免外援DNA等因素的污染而造成干扰实验,PCR操作时要注意做到:
    ①隔离操作区:所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌;
    ②分装试剂,简化操作程序,使用一次性枪头
    三、课题成果评价
    (一)理论上DNA扩增的计算
    1、一条DNA,复制n次,DNA为2的n次方
    2、a条DNA,复制n次,DNA为a乘以2的n次方
    (二)实验中1、一条DNA,复制n次,DNA为2的n次方含量的测定
    1、原理
    可以通过计算1、一条DNA,复制n次,DNA含量评价扩增的效果,DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,峰值的大小与DNA的含量有关
    2、过程
    ①稀释
    PCR反应液,加入98ul蒸馏水,即将样品进行50倍稀释
    ②对照凋零
    以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处,将紫外分光光度计的读数调至零
    ③计算
    取DNA稀释液100ul至比色杯中,测定260nm处的光吸收值
    ④计算
    DNA含量(ug)=50×(260nm的读数)
                      ×稀释倍数
    50:1ug/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02
    五、实验小结
    PCR仪加热使(模板)变性,复性使引物与模板DNA(互补),延伸需将反应温度升至中温(72℃),在(Taq聚合酶)的作用下,以四种脱氧核苷酸为原料,以(引物)为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经(变性、复性和延伸)三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。

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