课程内容

《酵母细胞的固定化》
一、课题目标
1、简述固定化酶的概念
2、说出酶固定化的方法
3、尝试用包埋法植被固定化酵母细胞
4、探讨固定化酶的应用价值
固定化酶
将分离提纯后的酶固定到一定的载体上，使用时将固定的酶投放到反应溶液中，催化反应结束后，又能将被固定的酶回收，这样的酶叫做固定化酶。
基础知识
（一）固定化酶的应用实例
1、利用固定化酶技术生产高果糖浆的实例
（1）高果糖浆的生产需要酶葡萄糖异构酶
（2）葡萄糖异构酶的优点
稳定性好、可以持续发挥作用
（3）在生产中直接使用酶有什么缺点？
酶溶解于葡萄糖溶液后，无法回收，造成浪费
2、固定化酶的反应柱示意图
使用固定化酶技术，将葡萄糖异构酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这种酶颗粒装在一个反应柱内，柱子底端装有分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入。
3、固定化酶的生产实践中的优点：
反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量
酶既能与反应物接触，又容易与产物分离，提高产品质量；同时固定在载体上的酶还可以反复利用，节约成本。
4、固定化酶的其他应用实例
采用固定化酶技术生产L-氨基酸。1969年，日本利用固定化氨基酰酶，由乙酰化-DL-氨基酸连续生产L-氨基酸获得成功。是世界上固定化酶大规模应用的首例。
1974年以来，已能将曲霉的安氨基酰化酶固定在DEAE-Sphadex上生产出L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸等。工业成本降低约40%，产品广泛用于食品、医疗、农业等。
用于化验诊断。能够化验血糖数值的血糖快速测试仪。血糖快速测试仪实际上是利用有关的固定化酶制成的一种传感器。酶传感器主要是由固定化酶膜和交换器组成：固定化酶膜可以选择性的“识别”被检测的物质，并催化被“识别”出的物质发生化学反应；交换器则把这一催化反应中产物的变量转换成电信号，进而通过仪表显示出来。
酶传感器还可以用于水质监测。例如，酚是一类对人体有害的化合物，科学家利用固定化多酚氧化酶研制成多酚氧化酶传感器，可以快速测定出水中质量分数仅有2×10^-7的酚
（二）固定化细胞技术
（1）固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
（2）包括包埋法、化学结合法和物理吸附法
（3）酶适合采用化学结合法和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞个大，而份分子很小；个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包买材料中漏出
（4）酶的几种固定方式
（1）包埋法：将酶包埋在细微网格里
（2）化学结合：法将酶相互连接起来
（3）物理吸附法：将酶吸附在载体表面上
（5）包埋法固定化细胞
固定化细胞是指固定在一定空间范围内、能够进行生命活动的并且可以反复使用的活细胞。固定化细胞技术主要应用在一些需要红细胞进行持续的处理的生产过程，大多数与微生物有密切的关系，如酒精的生产、污水的处理等。
包埋法固定化细胞是将微生物细胞均匀包埋在不溶于水的多孔性载体中。
常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维和聚丙烯酰胺等。
2、固定化酶和固定化细胞的联系与区别
联系：都是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。在生产中都容易与产物分离，固定在载体上的酶或细胞可以反复利用。
区别：适宜的固定方法不同；固定化细胞技术更适宜于生产实际。
1）固定化细胞技术操作容易，成本低，容易回收；
2）固定化细胞技术对酶活性影响更小；
3）固定化细胞固定的是一系列酶
4）由于大分子难以通过细胞膜，因此固定化细胞的应用有一定的限制；
实验操作
（一）制备固定化酵母细胞
酵母细胞的活化
在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。酵母细胞所需要的活化时间较短，一般需要0.5~1h。此外，酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。
2、配制物质的量浓度为0.05mol/l的CaCl2溶液
CaCl2的作用是使海藻酸钠胶体发生聚沉，形成凝胶珠
3、配制海藻酸钠的溶液
注意加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠融化为止。加热使海藻酸钠溶液是操作中最重要的一环。海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。
4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合
将海藻酸钠溶液冷却至室温，加入活化酵母细胞，充分搅拌，转移至注射器。
5、固定化酵母细胞
以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配置好的CaCl2溶液中，滴加在CaCl2溶液中形成凝胶珠，凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30分钟。
刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法，一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。
实验操作
（二）用固定化酵母细胞发酵
1、将固定化的酵母细胞（凝胶珠0用蒸馏水冲洗2到3次。
2、将150ml质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200ml的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25摄氏度下发酵24h。
利用固定化酵母细胞产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。
细胞的固定化要在严格的无菌条件下进行；反复使用固定化酵母细胞时，需要避免微生物的污染。
在应用固定化酵母细胞时，需要避免微生物的污染。
在应用固定化酵母细胞进行酒精发酵时要注意控制好温度，保证缺氧的环境，并且发酵时间要稍长一些，增强实验效果。
练习1：直接使用酶、使用固定化酶和使用固定化细胞催化反应，各有哪些优点和不足？

类型	优点	不足
直接使用酶	催化效率高，低耗能、低污染	对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。
固定化酶	酶既能与反应物接触，又能与反应物分离，同时固定在载体上的酶还可以被反复利用。	一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到。
固定化细胞	成本低，操作更容易	固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降。

例1  关于固定化酶技术说法正确的是（D）
A、固定化酶技术就是固定反应物，将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术
B、固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应
C、固定化酶中的酶无法重复利用
D、固定化酶是将美固定在一定空间的技术
2、在制备固定化酵母细胞的过程中，CaCl2溶液的作用是（C）
A、用于调节溶液的PH
B、用于进行离子交换
C、用于胶体聚沉
D、用于为酵母菌提供钙离子
3、下列不属于固定化酶在利用时的特点是（C）
A、有利于酶与产物分离
B、可以被反复利用
C、能自由出入依附的载体
D、一种固定化酶一般情况下不能催化一系列酶促反应
例4 下列关于固定化酶酵母细胞制备步骤不恰当的是（C）
A、应使干酵母与水混合并搅拌，以利用酵母菌活化
B、配置海藻酸钠溶液时要用小火间断加热的方法
C、向刚融化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀
D、将与酵母混合的海藻酸钠液滴加入CaCl2溶液中，会观察到CaCl2溶液中有球形或椭球形的凝胶珠形成