课程内容

《分解纤维素的微生物的分离》
（一）纤维素与纤维素酶
纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。地球上含量最丰富的多糖。
纤维素酶：由微生物分泌的一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分解成葡萄糖。
纤维素—→（C1酶、Cx酶）—→纤维二糖—→（葡萄糖、苷酶）—→葡萄糖
实验：纤维素酶分解纤维素的实验
①取二支20ml的试管
②各加入一张滤纸条
③各加入PH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液11ml和10ml
④在乙试管中加入1ml纤维素酶
⑤两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上震荡1h
⑥结果：乙试管的滤纸条消失
（二）纤维素分解菌的筛选
刚果红染色法
刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
用加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物时，如果培养基中出现已菌落为中心的透明圈时，可说明该菌落是纤维素分解菌，因为它已将被刚果红染成红色的纤维素分解了。
一、实验设计
请你更加实验流程图和提供的三个资料以及“操作提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。
土壤取样—→选择培养—→梯度稀释—→将样品涂布的鉴别纤维素分解菌的培养基上—→筛选产生透明圈的菌落
1、本实验的流程与课题2中的试验流程有哪些异同？
本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。
2、为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
3、将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？
将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。
阅读与思考  阅读教材28-29页“资料一”“资料三”并思考相关问题
问题一：是液体培养基，因为没有添加琼脂
问题二：具有筛选作用，因为培养基中的碳源是纤维素，该培养基只有能分泌纤维素酶的纤维素分解菌才能生长。
问题三：“资料三”中的两种方法各有哪些优点和不足，你打算选哪一种？
刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经超过有20年的历史，在本课题中我们给出了两种方法。方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂的问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反映。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。
问题四：为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
在选着培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
二、实验案例
土壤中纤维素分解菌的分离
1、土样采集：土样采集的方法与本专题课题2类似。土样的此埃及要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。
2、选择培养：选择培养需要的仪器有：250ml锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1ml和10,ml的移液管、天平、摇床、温度计等
在250ml锥形瓶中装入30ml选择培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
选择培养的操作：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30ml培养基的摇瓶中，将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1-2d，至培养基变浑浊，重复上述方法再培养一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。
3、刚果红染色法分离：纤维素分解菌这一步所需要的仪器有：无菌培养皿、涂布器、1ml移液管，装有9ml无菌水的20ml大试管，温箱等。
培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在50ml三角瓶中装入200ml培养基，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15~20ml培养基，凝固后待用。
制备菌悬液：按照本专题课题1的稀释操作方法，将选着培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数至10^6。
涂布平板：将稀释度数为10^4~10^6的菌悬液各取0.1ml，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，在30℃倒置培养，至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照。刚果红染色的具体操作步骤参照课本[资料三]。
三、结果分析与解释
1、培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落
对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格，如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。
2、分离的结果是否一致
由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌，但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。
土壤取样—→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌数量的多少来确定）—→梯度稀释—→将菌悬液涂布到特定选择作用的培养基上—→挑选单菌落—→发酵培养