课程内容

《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》
两个主要目的：
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
（2）统计每克土样样品中究竟含有多少这样的细菌。
CO(NH2)2+H2O—（脲酶）→CO+2NH3
（一）筛选菌株
水生耐热细菌Taq
耐高温的Taq DNA聚合酶
美国微生物学克布鲁克
1966年发行耐热细菌
根据水生耐热细菌Taq筛选过程，P22旁栏思考？
选择培养基
在微生物学中，将允许特点种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
（二）统计菌落数目
统计菌落数目的理论依据
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落。来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30~300的平板进行计数。
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为10%的培养基中，得到以下两种统计结果。
1、第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230.
2、第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分布为21、212和256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为哪位同学的结果接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？
说明设置重复组的重要性：第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力，第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误。因此，不能简单地讲3个平板的计数值用来求平均值，这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，在分析实验结果时，一定要考虑设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。
注意：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。
每克样品中的菌株数＝（C÷V）×M
C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V：涂布平板时所用的稀释液的体积（ml）
M：稀释倍数
（二）设置对照
在本课题的实验时，A同学从对应10^6倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择大约50个菌落。
其他同学认为A同学的结果有问题。他们分析可能是A同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。
但是，A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿不出令同学们信服的证据。
你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？
究竟是哪个原因，可以通过实验来证明，实验方案有两种。一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土壤进行试验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一个方案是将A同学配置的培养基在不加同土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染，通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
实验设计
[一]土壤取样
从肥沃、温润的土壤中取样，先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
[二]样品的稀释
样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目，实际操作中。通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30-300之间，适于计数的平板。
测定土壤中细菌的数量，一般选用10^4，10^5，10^6倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用10^4，10^5，10^6倍稀释；测定真菌的数量。一般选用10^4，10^5，10^6倍稀释，根据这些数据。请你思考胖栏中的问题。
当你第一次做这个实验的时候，可以得到稀释的范围放宽一点。例如，可以得10^5-10^5倍的稀释液分布涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30-300间的平板进行计数。
[三]微生物的培养与观察
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间，细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d；放线菌一般在25-28℃的温度下培养5-7d，而霉菌一般在25-28℃的温度下培养3-4d，本实验中，我们可以每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。这样可以防止因培养时间不是而导致遗漏菌落的数目。
一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基，温度及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。
操作提示
[一]无菌操作
1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌
2、应在火焰旁称取土壤，在火焰附近将你称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞
3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作
[二]做好标记
注明培养基种类、培养日期，平板培养样品的稀释度等
[三]规划时间
结果分析
1、结合对照、分析培养物中是否有杂菌污染以及选培养基是否筛选出一些菌落
2、是否获得了某一稀释度下，菌落数目在30--300的平板，在这稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相近？
3、你统计的每克土壤中含有分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？
课题延伸
PH升高指示剂（酚红）将变红
CO(NH2)2+H2O—脲酶→CO2+2NH3
（一）空气中微生物总数的检测
（二）水中细菌总数的检测
（三）牛奶中细菌的分离与计数
（四）土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数